2、染色菌的選擇 

菌齡對(duì)革蘭氏染色結(jié)果的影響是十分大的。我們?nèi)旧^(guò)程中選擇的菌應(yīng)該是處于活躍生長(zhǎng)期，這樣的細(xì)菌活性強(qiáng)，生理特征明顯，所以染色的結(jié)果準(zhǔn)確度高，一般情況下不會(huì)出現(xiàn)誤差。培養(yǎng)時(shí)間較長(zhǎng)的革蘭氏陽(yáng)性菌，由于細(xì)胞老化，甚至有部分菌在染色之前就已經(jīng)死亡或者自行溶解了，造成細(xì)胞壁通透性增加，就會(huì)呈現(xiàn)出假陰性。以金黃色葡萄球菌為例，金葡是典型的革蘭氏陽(yáng)性菌，有人曾經(jīng)統(tǒng)計(jì)過(guò)培養(yǎng)至不同時(shí)間的金葡的革蘭氏染色結(jié)果，結(jié)果表明，在金葡活躍期的22h-26h之間，染色結(jié)果的準(zhǔn)確率基本可以達(dá)到100%，而超過(guò)26h之后，準(zhǔn)確率就開始下降，培養(yǎng)至36h時(shí)，準(zhǔn)確率大概會(huì)下降30%左右。所以我們?cè)谌旧珪r(shí)，一定要選擇處于活躍期、活性較強(qiáng)的菌落，在檢測(cè)過(guò)程中一定要嚴(yán)格的在國(guó)標(biāo)要求的時(shí)間段內(nèi)進(jìn)行染色試驗(yàn)，不能提前或者延后。

3、涂菌的狀態(tài)

在染色最初的涂布中，在挑取菌體后應(yīng)該在無(wú)菌水上涂成薄薄的菌膜。而在涂布過(guò)程中，若是菌體堆積，也會(huì)極大影響染色結(jié)果的準(zhǔn)確性。菌落堆積過(guò)多，往往菌體之間變得毫無(wú)縫隙，而其細(xì)胞壁的成分影響造成了脫色的情況不佳，容易產(chǎn)生假陽(yáng)性的結(jié)果。同時(shí)，在初染、媒染及復(fù)染的過(guò)程中，應(yīng)將染液覆蓋整個(gè)菌膜，避免一部分菌染色而另一部分菌沒有染色。因此在涂片過(guò)程一定要將菌膜涂得少而均勻，這樣才能達(dá)到最佳效果。

4、媒染時(shí)間

媒染時(shí)間對(duì)革蘭氏陰性菌的染色結(jié)果有很大影響。由于媒染時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，結(jié)晶紫在碘液長(zhǎng)時(shí)間作用下過(guò)分牢固結(jié)合在菌體細(xì)胞壁上，影響了酒精的脫色效果，從而會(huì)導(dǎo)致這種假陽(yáng)性的效果。以典型的革蘭氏陰性菌大腸埃希氏菌為例，有人做過(guò)統(tǒng)計(jì)，媒染時(shí)間嚴(yán)格控制在40s-60s之內(nèi)，染色結(jié)果準(zhǔn)確率基本可達(dá)到100%，而超過(guò)60s準(zhǔn)確率會(huì)有一定的降低，若媒染超過(guò)100s，準(zhǔn)確率甚至可降低接近20%左右。因此在媒染過(guò)程中一定要注意媒染時(shí)間，控制在50-60s為宜。

5、酒精脫色

酒精脫色也是一個(gè)對(duì)結(jié)果影響較大的操作過(guò)程。革蘭氏陰性菌和革蘭氏陽(yáng)性菌最主要的差異是細(xì)胞壁肽聚糖層厚度和結(jié)構(gòu)，革蘭氏陰性菌細(xì)胞壁肽聚糖層很薄，脂多糖含量高因此在酒精脫色時(shí)，細(xì)菌細(xì)胞壁的多糖成分會(huì)被酒精溶解，增大了細(xì)胞壁的通透性，結(jié)晶紫及碘復(fù)合物就很快被酒精洗脫，之后就會(huì)被沙黃復(fù)染呈紅色；而陽(yáng)性菌肽聚糖層厚，脂多糖少，酒精只能起到脫水效果而無(wú)法進(jìn)入，這樣結(jié)晶紫和復(fù)合物就無(wú)法洗脫出來(lái)使細(xì)胞呈紫色。因此，酒精脫色時(shí)間短，脫色效果不佳，會(huì)導(dǎo)致陰性菌菌體內(nèi)的結(jié)晶紫和復(fù)合物不能有效的全部洗脫出來(lái)，就會(huì)出現(xiàn)明顯的誤差，使陰性菌出現(xiàn)假陽(yáng)性。而洗脫時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，也會(huì)導(dǎo)致陽(yáng)性菌的細(xì)胞壁被酒精破壞，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)的紫色被洗脫，呈現(xiàn)假陰性。因此洗脫時(shí)間也是革蘭氏染色的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。洗脫時(shí)間應(yīng)當(dāng)嚴(yán)格控制在20s-30s之間，同時(shí)保證洗脫效果。